שיבוט מולקולרי

שיבוט מולקולרי הוא סדרה של שיטות בביולוגיה מולקולרית המשמשות להרכבת מולקולות DNA רקומביננטיות ולשכפולן באמצעות פונדקאי. שיבוט מולקולרי נמצא בשימוש נרחב, והכרחי ולשיטות רבות בעולם המדע והרפואה. השימוש במונח שיבוט מתייחס לכך שבתהליך נוצרים עותקי DNA רבים הזהים למקור. שיבוט מולקולרי עושה שימוש לרוב ב-DNA משני מקורות: מאורגניזם אחד משמש כמקור ל-DNA שיעבור שיבוט, ומאורגניזם שני שישמש כפונדקאי לתהליך השכפול. שיבוט מולקולרי מתאפשר כיוון שהמבנה הכימי של DNA, משותף בין כל היצורים החיים. לפיכך מערכת השכפול של הפונדקאי יכולה להתמודד עם DNA זר.

בשיבוט מולקולרי שגרתי, DNA מהאורגניזם הרצוי מעוכל במבחנה על ידי אניזמי הגבלה כדי ליצור מקטעי DNA קצרים. מקטעים אלו מודגרים עם נשא (וקטור), המשמש שלד ליצירת מולקולת DNA מעגלית (פלסמיד). מולקולה רקומביננטית זו מוכנסת לפונדקאי (בדרך כלל מדובר בזן שפיר, קל לגידול של החיידק אי קולי). כחלק מתהליך השכפול הטבעי של הפונדקאי, ישוכפל גם ה-DNA הרקוביננטי. כיוון שמקור ה-DNA הוא זר, חיידקים אלו נחשבים טרנסגניים או אורגניזם מהונדס גנטית (GMO).

תהליך השיבוט המולקולרי מתבסס על העובדה שחיידק יכול לקלוט DNA מעגלי זר, ולשכפלו כחלק מהשכפול הטבעי שלו. מכיוון שחיידקים גדלים בצורה מעריכית, באמצעות שימוש בחיידקים בעלי זמן דור קצר ניתן להגיע בפרק זמן של שעות לעותקים רבים הזהים ל-DNA הרקומביננטי שהוכנס לפונדקאי. נהוג לכנות הן את החיידקים שנוצאו והן את מולקולת ה-DNA הרקוביננטי שיבוטים.

כל מקטע DNA יכול לעבור שיבוט מולקולרי, אך ישנם גורמים שעלולים להגביל את הצלחת התהליך. לדוגמה, רצפי DNA המכילים חזרות הופכיות, מקור שכפול, צנטרומרים וטלומרים. היעילות פוחתת במקטעי DNA ארוכים; אך ניתן לשבט מקטעים מעל 10,000 זוגות בסיסים ועד 40,000 זוגות בסיסים בבקטריופאג'ים כגון בקטריופאג' למדא.

שיבוט מולקולרי דומה לתהליך PCR בכך ששניהם משכפלים רצפי DNA. ההבדל העקרוני בין שתי השיטות הוא ששיבוט מולקולרי נעשה ביצור חי (אין ויוו), ו-PCR נעשה במבחנה (אין ויטרו). מקטע DNA משובט נושא פחות מוטציות מאשר תוצר PCR.

היסטוריה

לפני 1970, ההבנה של גנטיקה וביולוגיה מולקולרית הייתה מוגבלת כיוון שלא היה ניתן לבודד גנים בודדים מתוך יצורים מורכבים. מיקרוביולוגים חיפשו דרך להבין מנגנונים שבאמצועתם חיידקים מגבילים את גידולם של בקטריופאג'ים, והצליחו לבודד אניזמי הגבלה, אשר מבקעים DNA דו גדילי בתנאי שמכיל רצף הכרה מסוים. המדענים הראו כיצד אנזים הגבלה מבקע כרומוזום בנקודות מסוימות, ושניתן להפריד בין המקטעים שנוצרו באמצעות הגודל השונה שלהם. באמצעות שימוש באנזים נוסף DNA ליגאז, ניתן לחבר את המקטעים שנוצרו בצורה חדשה, ובכך ליצור DNA רקומביננטי. באמצעות הכנסה של מקטעי DNA רקומביננטי לנשא (פלסמיד חיידקי או בקטריופאג'י לדוגמה) אשר יכול באופן טבעי להשתכפל בחיידקים, ניתן לבודד כמות גדולה של אותו מקטע DNA רקומביננטי מתרבית חיידקים. מקטעי ה-DNA הרקומביננטי נוצרו ונחקרו בשנת 1972.

שלבים

כל שיבוט דורש יצירת אסטרטגיה המתאימה לרצף ה-DNA המיועד להגברה ולנשא, כמו בחירת אנזימי ההגבלה שישמשו לתהליך. עם הזמן נוצרו כלים ייעודיים העוזרים בתכנון ועיצוב שיבוט מולקולרי, כמו ApE, DNAStrider, Collagene (תוכנות קוד פתוח). בכלים אלו (ואחרים, חלקם חינמיים וחלקם מסחריים) ניתן להכניס את רצפי ה-DNA, לבחור אנזימי הגבלה מתאימים ולעצב את הפלסמיד הרצוי. ישנם כלים נוספים המיועדים לשיבוטים נרחבים יותר, כמו יצירת ספרייה של פלסמידים המכילים מקטעים שונים.

תהליך רגיל של שיבוט כולל כמה שלבים:

1. בחירת פונדקאי ונשא;
2. הכנת הנשא;
3. הכנת המקטע המיועד לשיבוט;
4. יצירת פלסמיד DNA רקומביננטי על ידי ליגציה של הנשא עם המקטע;
5. הכנסת הפלסמיד לפונדקאי;
6. גידול אוכלוסיית הפונדקאים וברירת אלו המכילים את הפלסמיד;
7. סריקה של השיבוטים לזיהוי המקטע הרצוי;

1. בחירת פונדקאי ונשא

ישנו מגוון רחב של פונדקאים ונשאים הנמצאים בשימוש. עם זאת, רוב השיבוטים המולקולריים נעשים באמצעות החיידק אי קולי, המשמש כפונדקאי רב תכליתי, זמין, עם קצב שכפול מהיר הדורש ציוד מינימלי לגידול. אם מקטעי ה-DNA הם גדולים במיוחד, ניתן להשתמש בכרומוזום חיידקי מלאוכתי (BAC) או בכרומוזום שמרי מלאוכתי (YAC).

מטרת השיבוט המולקולרי תשפיע על הבחירה. לדוגמה, אם מטרת השיבוט המולקולרי הוא חלבון המתורגם ממקטע ה-DNA הרקומביננטי, יש לבחור נשא שיכיל את האותות הנדרשים לתהליך השעתוק והתרגום בפונדקאי. לעיתים הנשא מותאם לביטוי ביצור נוסף מעבר לפונדקאי, אשר משמש כשלב ביניים לפני יצירת יצור טרנסגני אחר (פלסמיד Ti לביטוי בצמח, לדוגמה).

ישנם ארבעה מאפיינים חיוניים המשותפים לרוב הנשאים:

• מקור שכפול, כדי לוודא שהפלסמיד ישוכפל בפונדקאי.
• אתר הכרה ייחודי אחד או יותר לאנזימי הגבלה, המשמש להכנסת מקטע ה-DNA לנשא.
• גן המשמש לברירת הפונדקאים שקלטו את הפלסמיד.
• תג DNA המשמש לסריקת הפונדקאים כדי לאתר את התוצרים הרצויים.

2. הכנת הנשא

ביקוע DNA דו גדילי באמצעות אנזים ההגבלה BamHI. רצף ההכרה הפלינדרומי מסומן במסגרת בחלק העליון, ובחלק התחתון ניתן לראות את הקצוות הדביקיים החד גדיליים שנוצרים בעקבות הביקוע.

הנשא המעגלי מבוקע על ידי אנזים הגבלה (אחד או יותר) ליצירת DNA ליניארי. ביקוע כזה יכול להותיר קצוות קהים (שיכולים לעבור ליגציה עם כל קצה קהה אחר, ללא תלות ברצף) או קצוות דביקיים (בהם אחד הגדילים ארוך מהשני, וזמין ליצור זיווג בסיסים, ראו איור). חיתוך הנשא ומקטע ה-DNA באנזים זהה (או שמשאיר קצה דביקי זהה) מאפשר לתכנן את כיווניות החיבור, ונחשב ספציפי יותר. רוב הפלסמידים הנמצאים בשימוש מכילים אזורי הכרה לאנזימי הגבלה, שהם אזורים המכילים סדרה של אתרי הכרה ייחודיים לשורה ארוכה של אנזימי הגבלה. אם הסדרת ממוקמת בגן כמו בטא גלקטוסידאז, ניתן להשתמש בו לברירת הפונדקאים בשלב מאוחר יותר. על מנת למנוע סגירה חוזרת של הנשא (ויצירת חיוביים שגויים), ניתן להשתמש בשני אנזימים שונים מאזור ההכרה אשר אינם יוצרים קצוות דביקיים משלימים, ובנוסף להשתמש בפוספטאז, המוריד את הזרחן ובכך מונע ליגציה עצמית. רק אם יוחדר שם מקטע DNA שישלים את הפלסמיד יתבצע שכפול בפונדקאי.

3. הכנת המקטע המיועד לשיבוט

על מנת לשבט מקטע גנומי, יש לבודד את המקטע מתוך הגנום. מכיוון שרוב התאים ביצור מכילים את כלל ה-DNA של היצור, ניתן להשתמש בכל רקמה כמקור (כולל רקמות של חיות שנכחדו), כל עוד ה-DNA לא התפרק. ה-DNA עובר ניקוי כדי להסיר חלבונים, RNA ומולקולות קטנות אחרות, ולאחר מכן מקטע ספציפי מוגבר באמצעות PCR. ניתן להשתמש גם ב-RNA, באמצעות המרתו ל-DNA בתגובת RT-PCR.

ניתן לחלופין לעצב DNA סינתטי. דבר זה נדרש על מנת להתאים את הרצף לקוד הגנטי כאשר מעבירים גן בין מערכות שונות (לדוגמה, בין הגרעין למיטוכונדריה), או באמצעות אופטימזציה של הקודונים כדי להעלות את רמות הביטוי.

אם נעשה שימוש בקצוות DNA קהים, אין צורך לבצע שלב נוסף. אם נעשה שימוש בקצוות DNA דביקיים, מקטע ה-DNA מבוקע גם כן על ידי אנזימי הגבלה שיתירמו לרצף הדביק של הנשא. אם רצף ה-DNA לא מכיל אתר הכרה של אנזים הגבלה מתאים, ניתן בשלב ה-PCR להוסיף בתחל רצף הכרה לאנזים הרצוי.

4. יצירת פלסמיד DNA רקומביננטי על ידי ליגציה של הנשא עם המקטע

על מנת לחבר את הנשא (שנמצא במצב ליניארי, בעקבות הביקוע בשלב 2) עם מקטע ה-DNA, מדגירים את שני המרכיבים במבחנה יחד עם DNA ליגאז, היוצר קשר קוולנטי בין קצוות DNA. ה-DNA ליגאז עובד בצורה אקראית, כך שמלבד התוצר הרצוי עשויים להיווצר תוצרים נוספים, כמו נשא שנסגר מחדש ללא מקטע ה-DNA, נשא המכיל שני מקטעי DNA ברציפות וכדומה. אם הנשא בוקע בצורה שהשאירה קצוות קהים, מקטע ה-DNA יתחבר בשתי אוריינטציות. במצב של קצוות דביקיים, הכיווניות אמורה להישמר לפי זיווג הבסיסים. בשלב זה ניתן לבקע שוב את ה-DNA באנזים הגבלה שיבקע תוצרים לא רצויים, כמו נשא שנסגר על עצמו, ובכך להוריד את הרקע.

5. הכנסת הפלסמיד לפונדקאי

ישנן שיטות רבות להחדיר DNA לתוך תאים חיים, והשם של שלב זה ישתנה לפי השיטה (לדוגמה: טרנספורמציה, התמרה, טרנספקציה, אלקטרופורציה). כאשר חיידק מסוגל להכניס ולשכפל DNA מהסביבה, הוא נקרא חיידק קומפטנטי. על מנת להפוך חיידק להיות קומפוטנטי, נדרשים תנאי גידול מיוחדים וטיפול בחומרים כימיים מסוימים המשתנים בין הזנים השונים שבשימוש.

6. גידול אוכלוסיית הפונדקאים וברירת אלו המכילים את הפלסמיד

היעילות בכל אחת מהשיטות הידועות להכנסת DNA לפונדקאי נמוכה, כך שרק אחוז קטן מהפונדקאים אכן יכניסו את הפלסמיד לתוכם. באמצעות הגן המשמש לברירה מדענים יוצרים ברירה גנטית המאפשרת רק לפונדקאים המכילים את הפלסמיד להתרבות. בחיידקים השימוש הנפוץ הוא בגן עם עמידות לאנטיביוטיקה אשר נמצא בפלסמיד, והאנטיביוטיקה מוספת למצע הגידול. רק חיידקים בעלי עמידות (אותה רכשו באמצעות הפלסמיד) ישרדו.

7. סריקה של השיבוטים לזיהוי המקטע הרצוי

מבין החיידקים ששרדו את שלב הברירה, יש לאתר את החיידקים המכילים את הפלסמיד הרצוי. ישנן מערכות המתבססות על שינוי צבע, וכך ניתן לאתר בצורה חזותית מושבות חיידקים המכילות את הפלסמיד. כמעט תמיד ישנו צורך לבדוק מספר מושבות כדי לאתר את אלו המכילות את הפלסמיד המדויק הרצוי. ישנן שיטות רבות לבצע זאת, כמו תספיג DNA, תספיג חלבון, PCR, ריצוף DNA.

יישומים

שיבוט מולקולרי מאפשר למדענים ליצור כמויות רבות של מקטעי DNA מכל מקור, היכולים לשמש הן לתחומי מחקר בסיסי והן לשימושים יישומיים. להלן כמה דוגמאות:

ארגון גנום וביטוי גנים

שיבוט מולקולרי הוביל בצורה ישירה לפענוח גנומים של יצורים רבים ולמחקר אודות הגיוון הגנומי. מגבלות הריצוף למקטעים קצרים הצריך את חלוקת הגנום למקטעים קטנים, שעברו שיבוט, ובאמצעות חיבור החלקים החופפים הורכבו הגנומים.

ברמת הגן הבודד, שיבוטים גנטיים משמשים ליצירת גלאי ביולוגי, המשמש למדידת רמות ביטוי של גנים, וכיצד רמות ביטוי אלו קשורות לתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הסביבה המטבולית, אותות חוץ תאיים, התפתחות, למידה ומוות תאי. גנים משובטים משמשים כלים לבחינת פעילות ביולוגית וחשיבות של גנים בודדים, באמצעות ביצוע מניפולציות שונות על הרצף ומדידת התוצאות.

יצירת חלבונים רקומביננטיים

כאשר ישנו רצף DNA תקין, ניתן להכניסו למערכת המסוגלת לבטא את החלבון המצוי בו. משימה זו קשה עשרות מונים מאשר שיבוט DNA, מכיוון שלחלבון דרושים אותות רבים נוספים, וכן נדרש קיפול, יציבות, הובלה ומודיפקציות שונות. עם זאת, ישנם חלבונים רקומביננטיים שונים הזמינים כיום לשימוש, ובהם:

• חלבונים המשמשים לטיפול במחלות בהם ישנו חוסר בחלבון מסוים, לדוגמה מתן של פקטור VIII רקומביננטי לצורות מסוימות של המופיליה ומתן של אינסולין רקומביננטי לצורות מסוימות של סוכרת.
• חלבונים הניתנים במטרה לטפל במצבים מסכני חיים. לדוגמה מפעיל פלסמינוגן רקמתי שניתן באירועים לבביים.
• חלבונים רקומביננטיים חלקיים המשמשים לחיסון, כך שאין צורך לחשוף את האדם לפתוגן עצמו, כמו חיסון להפטיטיס B.
• חלבונים רקומביננטיים במשמשים לאבחון במעבדות.

יצורים טרנסגניים

באמצעות שיבוט מולקולרי ניתן ליצור אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO). אף על פי שרוב היצורים מהונדסים גנטית לצורכי מחקר, ישנן יצורים שונים ששובטו לצרכים מסחריים, כמו יצירת זני צמחים עמידים לקוטלי עשבים, ייצור תרופות בתאי צמחים ויצירת דגי נוי (GloFish).

ריפוי גני

בתהליך ריפוי גני מספקים לתא גן פעיל כתחליף לגן פגוע (בצורה גנטית או נרכשת). השימוש בריפוי גני עוד נמצא בחיתוליו, אך צופים לו עתיד מזהיר.

ראו גם

• הנדסה גנטית

קישורים חיצוניים

מדיה וקבצים בנושא שיבוט מולקולרי בוויקישיתוף

• סרטון על שיבוט מולקולרי, מכון דוידסון
• שיבוט, ביטוי, קיפול וניקוי חלבונים מהונדסים גנטית המשמשים לטיפול תראפויתי – המצב כיום, ד”ר אביגדור לבנון
• הפלסמיד כאמצעי להנדסה גנטית, ד"ר ארז גרטי
• שיבוט מולקולרי, דף שער בספרייה הלאומית