Real Time PCR
Real Time PCR (בעברית: PCR בזמן אמת) הנקראת גם quantitative polymerase chain reaction או בקיצור qPCR (תגובת שרשרת פולימראזית מכמתת), היא שיטה להגברת DNA באמצעות PCR בנוכחות חומר פלואורסצנטי הזוהר בנוכחות רצף DNA ועירור על ידי אור. השיטה נבדלת מה-PCR המסורתי בכך שהיא כוללת קריאה של כמות ה DNA הנוצר כבר במהלך התגובה, ולא רק בסופה. Real Time PCR משמש לגילוי ולכימות של רצפי DNA.
לשיטה זו חשיבות רבה בביולוגיה המולקולרית כאשר רוצים להשוות את הכמות היחסית של מולקולות mRNA ברקמה או בתא מסוים לכמות היחסית ברקמה אחרת או בתא אחר. כמו כן, לשיטה חשיבות רפואית-יישומית במחקר רפואי של עמידות לתרופות, כגון כימותרפיה ואנטיביוטיקה. ההבדל בין Real Time PCR לבין PCR רגיל הוא שבשיטת Real Time PCR נעשה ה-PCR במתקן ייחודי המאפשר לעקוב אחרי כמות מקטע ה-DNA שעובר הגברה (אמפליקון) בזמן התגובה עצמה, כך ניתן למצוא הבדלים בכמויות cDNA של דוגמאות שונות.
כדי לקבוע את כמות האמפליקון בכל דוגמה, ריאקצית ה-PCR מבוצעת במבחנות חדירות לאור ובנוכחות פלואורופור – חומר פלואורסצנטי כדוגמת SYBR-GREEN המסתפח ל-DNA דו גדילי ביחס קבוע לאורך, ולמספר המולקולות הנמצאות במבחנות השונות. זיהוי סימון ה-DNA נעשה בעזרת מקור אור, דוגמת לייזר, הלוגן או לדים עם עוצמה גבוהה שגורמים לעירור (excitation) ובעקבותיו לפליטה פלואורסצנטית של הפלואורופור. הפליטה הפלואורסצנטית מזוהה על ידי גלאי, ומועברת למחשב לניתוח. במחשב מותקנת תוכנה המאפשרת לקבוע מהו מספר מחזורי ה-PCR שנדרש לדוגמה להגיע לרמת פלואורסצנציה משמעותית מעבר לרמת הרקע. ערך זה משמש להערכה כמותית של כמות הדוגמה.
בבסיס השיטה עומדת ההנחה שבכל מחזור של ה-PCR מוכפלת כמות המולקולות של תוצרי ה-PCR פי 2 בדיוק, ניתן לאמת זאת על ידי הרצת מבחנות עם מיהולים ידועים של DNA ובחינה של הפרשי המחזורים ביניהם. למשל לאחר מהילה של דוגמה מסוימת פי 8, צפוי עיכוב של 3 מחזורים בדיוק בדוגמה במהולה ()
הערכה כמותית נעשית בשני אופנים:
- באופן עקיף, ביחס לדוגמה של גן שהתבטאותו חיונית house keeping gene (המכונה גן מנרמל - Normalizer) כגון אקטין. כאשר ההנחה היא שגן שמתבטא יותר, הפליטה שלו תעלה באופן משמעותי על פני פליטת הרקע במספר קטן יותר של מחזורי PCR. את התוצאה המתקבלת מנרמלים על ידי חלוקת מספר מחזורי ה-PCR שעברה הדוגמה עד לזהירה משמעותית במספר מחזורי ה-PCR שעבר הגן במבחנת הביקורת.
- באופן ישיר, ניתן לכמת בהתבסס על עקום כיול ספציפי לגן. כאשר מכניסים כמות ידועה של DNA למבחנות שונות, ומודדים את מספר המחזורים שלוקח לכל כמות של דוגמה להגיע לזהירה משמעותית.
ישנן שיטות נוספות לכימות רמת ביטוי של רנ"א: בעבר השתמשו ב- תספיג רנ"א ומערכי DNA, שיטות אלו נעלמו מהמחקר עם התחזקות שיטות הריצוף והגישות החישוביות לניתוח נתונים, וכיום ניתן לרצף ברמת התא הבודד ואף לקבוע את מספר המולקולות המדויק בתא.
אין לבלבל RT(real time) PCR עם RT(reverse transcriptase) PCR המשתמש באנזים ויראלי על מנת להפוך תחילה את גדילי הרנ"א שהופקו מהתאים לגדילי דנ"א. לריאקצית real time PCR הנדונה בערך זה, מוזנים גדילי cDNA מוכנים ולא RNA.
