משתמש:Lilachas87

תעלות מרצפות

תעלות מרצפות הן שיטה לקביעת הרצף של הבסיסים (נוקליאוטידים) המרכיבים גדילי דנ"א או רנ"א. השיטה מבוססת על חדירת הגדילים דרך ממברנה טבעית או מלאכותית בעלת חריר בקוטר של ננומטרים בודדים (תעלה יונית) הנמצאת בתוך תמיסה פיזיולוגית. מדידת שינוי המתח החשמלי בתמיסות בין שני צדדי הממברנה או בחריר עצמו- התלוי בסוג הבסיס החודר, מאפשרת את זיהוי אותו בסיס, על-ידי כך ניתן לרצף את הגדיל השלם.

הקדמה:

ריצוף דנ"א הוא תהליך שבו קובעים את רצף הנוקליאוטידים שמרכיבים מולקולת דנ"א נתונה. תהליך הריצוף מאפשר את פיתוח תעשיות המחקר הביולוגיות והתרופתיות ומכאן החשיבות לדיוק ולמהירות הריצוף. ריצוף דנ"א יכול לשמש כדי לקבוע את הרצף של גנים בודדים, אזורים גנטיים גדולים יותר, כרומוזומים מלאים או גנומים שלמים. בהתאם לשיטות, תוצאות הריצוף מספקות את סדר הנוקליאוטידים במולקולות הדנ"א שבודדו מתאים של בעלי חיים, צמחים, חיידקים,ארכיאות, וירוסים או כמעט בכל מקור אחר של מידע גנטי. הרצפים הסופיים משמשים חוקרים בתחום הביולוגיה או הגנטיקה להתקדמות מדעית נוספת בתחום הביולוגיה המולקולארית או הגנטית או עשוי להיות בשימוש על ידי אנשי צוות רפואיים לשם קבלת החלטות טיפול או סיוע בייעוץ גנטי.^[1]

היסטוריה:

בשנות ה-70 נצפה תהליך הריצוף הראשון של מולקולת דנ"א. את הריצוף ביצעו בשיטה המבוססת על כרומטוגרפיה דו ממדית ^[2]. השיטות הראשונות שפיתחו לריצוף דנ"א סיפקו ידע רב אך מנגד היו יקרות. בשנת 1977 פיתח פרדריק סנגר שיטה לריצוף דנ"א Sanger sequencing . שיטה זאת הייתה שיטה יקרה ואיטית לעומת הדרישה ההולכת וגדלה לריצוף מהיר וזול ^[3]. במהלך השנים התפתחו שיטות חדשות שמטרתם הייתה להקטין את העלויות ולהוריד את המחיר. שיטות אלו נקראות Next-generation. שיטות חדשות אלו כללו לדוגמא את שיטת pyrosequncing שמבוססת על ניתור ה-pyrophosphate) PPi) שמשתחרר במהלך ראקציית הפילמור של מולקולת הדנ"א^[4]. כיום מפתחים טכנולוגיות דור 3 במטרה להגדיל את התפוקה, לצמצם את זמן הריצוף ולהוריד את עליות הריצוף ע"י הקטנת השימוש בחומרים יקרים והגברת היעילות של דנ"א פולימראז^[1]. הרעיון של ריצוף דנ"א בשיטת תעלות מרצפות הוצע לפני יותר מ-20 שנה ^[5]^[6]. בתחילת שנות ה-90 שתי קבוצות עבדו באופן עצמאי על שיטת הריצוף בעזרת תעלות מרצפות. קבוצה אחת שבראשה עמד Mark Akeson וקבוצה שנייה בראשה עומד Jens Gundlach, דיווחו לראשונה בתחילת שנות ה-90 שניתן להעביר מולקולת דנ"א אחת דרך תעלה. שתי הקבוצות השתמשו בתעלה חלבונית ביולוגית. בנוסף, קבוצות אלו הראו כי מידע על רצף הנוקלאוטידים של מולקולת דנ"א חד-גדילית העוברת בתעלה, מוצג בזרם יונים שנמדד מהתעלה המרצפת בעת מעבר הגדיל דרך התעלה. זרם היונים שנמדד מהתעלה יכול להימדד ממולקולה בודדת של דנ"א (כלומר לא במצב הדו-גדילי של המולקולה). ריצוף בעזרת תעלות מרצפות מאפשר לרצף מקטעי דנ"א ארוכים. יתרון זה יאפשר בעתיד לרצף מולקולת דנ"א גנומית בזמן קצר ובאופן יעיל תוך כדי קבלת מידע על שינויים שחלו ברצף הגנטי כמו מקטעים שהוספו, מקטעים שהוסרו וכו'. למעשה, ריצוף בשיטה זו אינו מוגבל באורך הדנ"א. לשיטה זאת יתרון נוסף שכן, ניתן להשתמש בתעלה אחת לסוגים רבים של מולקולות דנ"א, כלומר השיטה אינה ספציפית אלא גנרית ולכן אינה דורשת הכנות מוקדמות, הגברה של המקטע וכו'^[7] ^[8].

שיטת תעלות מרצפות:

ריצוף בעזרת תעלות נעשה על ידי זיהוי האות החשמלי שנמדד מהתעלה בעזרת רישום אלקטרופזיולוגי של מתח הממברנה כאשר מולקולת הדנ"א עוברת בתוכה ^[9]^[10].

ישנם 3 עקרונות חשובים לביצוע מדידות אלקטרופזיולוגיות באמצעות תעלה:

1. מעבר יונים דרך התעלה כתלות במעבר הבסיסים דרכה.

2. התעלה צריכה להיות מספיק גדולה בשביל להכיל גם את המולקולה הנמדדת וגם את היונים שעוברים בתוכה. יש להתחשב גם בתכונות הידרו-דינמיות של היונים.

3. על הרישום להיות רגיש מספיק ובעל יחס אות-רעש סביר בשביל לדווח על ההבדל הקטן ביותר במולקולות הדנ"א שעוברת אנליזה, לדוגמא: היכולות להבחין בין מולקולות דנ"א בעלות מתילציה לבין כאלו החסרות אותה.

מעבר היונים בתוך התעלה הוא מהיר יותר מהמעבר של המולקולה הנמדדת. בכל 1μs (מיקרו-שנייה) של מעבר נוקלאוטיד ממולקולת הדנ"א בתוך התעלה מתקבל זרם של 20pA (פיקו-אמפר), שהוא שווה ערך למעבר של 124 יונים. כאשר מופיע זרם בתוך הממברנה שמכילה את התעלה, מתרחשות באלקטרודות 2 תגובות אלקטרוכימיות הפיכות:

1. תגובת חמצון בצד של האנודה : Ag(s)+Cl- −→AgCl(s)+e-.

2. תגובת חיזור בצד של הקטודה: AgCl(s)+e- −→Ag(s)+Cl-,.

בממברנה, היונים משתתפים גם ביצירת האות החשמלי הנמדד מהתעלה וגם ביצירת סיגנל הרעש. המדידה בתעלה מתקבלת בעקבות היונים שעוברים בתוך התעלה ומשלימים את המעגל האלקטרוכימי. לכל אחד מהנוקלאוטידים ישנה תגובה שמאופיינת לו באופן ספציפי, כלומר נמדד זרם שונה מהתעלה. כאשר נוקלאוטידים מסוג פורין יעברו בתוך התעלה נקבל סיגנל עמוק יותר ממעבר של נוקלאוטידים מסוג פרמידנים בתוך התעלה ^[9] ^[11].

סוגים של תעלות מרצפות:

עיקרון הריצוף בעזרת תעלות, מבוסס על כך שדנ"א חד-גדילי עובר דרך תעלה, והזרם היוני הנמדד, מעיד על סוג הנוקלאוטיד (אדנין (A), ציטוזין (C), גואנין (G) או תימין (T)) העובר בתעלה ברגע זה. הסוגים העיקריים של ריצוף בעזרת תעלות הם- התעלות הביולוגיות (Biological nanopores) ותעלות במצב מוצק ^[11] (solid-state nanopores),.

1. תעלות ביולוגיות (Biological nanopores): התעלות הביולוגיות, הינן חלבונים היוצרים נקבוביות בממברנה שומנית, דרכן יכולות לעבור מולקולות דנ"א. לתעלות הביולוגיות מספר יתרונות לאנליזת מולקולת דנ"א בודדת: א. תאים יכולים לייצר מספר רב של תעלות, בדיוק אטומי העולה על ייצור תעלות בדרך התעשייתית. ב. הגודל וההרכב של התעלות יכול להשתנות על פי הצורך. ג. ניתן להתאים את המאפיינים הכימיים והפיזיים של התעלות לפי השימוש הנצרך. אחד מהחלבונים הנפוצים בסוג זה של תעלות הוא (a-hemolysin pore (a-HL שקוטרו הפנימי הוא כ- 2 ננומטר (2nm). תעלה זו מורכבת מ-7 תת יחידות מונומריות, שהופקה מ- S. aureus. ייחודה של התעלה, מתבטא בכך שהיא נותרת פתוחה ב- pH ניטרלי ובמתח יוני גבוה.

2.תעלות במצב מוצק (solid-state nanopores): תעלות אלה עשויות לרוב מסיליקון, כאשר הסיליקון הנפוץ ביותר הוא סיליקון ניטריד. דרך ייצור התעלות, נעשה בשיטות שונות, כמו פיסול בעזרת קרן יונים ואלומות אלקטרונים. תעלות מסוג זה, יוצרו לראשונה ב- 2001, והפכו לאלטרנטיבה זולה ויעילה לתעלות הביולוגיות. היתרונות בשיטה הזו הן: א. היכולת להתאים את הגודל והצורה של התעלה לפי הצורך, בדיוק רב. ב. לתעלות אלו עמידות רבה לאורך זמן. ג. היכולת לייצר אותן בצפיפות גבוהה, תוך התאמה מעולה של מאפיינים מכניים, כימיים ותרמיים לעומת תעלות ביולוגיות. ד. תעלות אלו מאפשרות שילוב עם טכנולוגיית קריאת בסיסים אופטית ואלקטרונית ^[12] ^[13]^[14] .

ייעול עתידי של המערכת:

נניח כי קיימת תעלה מרצפת אידיאלית שניתן להעביר בה מולקולת דנ"א. התעלה לא יוצרת אינטראקציה חזקה עם הדנ"א היא רק רחבה מספיק בשביל להכיל את מולקולת הדנ"א ואת זרם היונים שעובר בתוכה במהלך ריצוף הדנ"א. בנוסף, כל נוקליאוטיד מספק זרם יונים שונה במהלך מעבר בתוך התעלה. השאלה שעולה מתוך ההנחה זאת ונשאלה ע"י חוקרים בנושא זה על מנת לפתח את הנושא ולהפוך את החזון למציאות: האם תעלה יונית מסוגלת באופן ישיר לרצף גדיל של מולקות דנ"א? על מנת שהחזון יהפוך למציאות יש להתמודד ולהמשיך לחקור את הקשיים שעלו בדרך. מעבר מונחה מתח של פולינוקליאוטיד בתוך התעלה הוא מאוד פשוט, עדיין התנאים המיקרוסקופים של המעבר של הגדיל בתוך התעלה לא נשלט באופן מלא בגלל מגבלות פנימיות של תהליך ההעברה בתוך התעלה. לדוגמא, תהליך הדיפוזיה הטבעית לתוך התעלה עדיין לא נחקר באופן משמעותי מספיק בשביל להגיע למסקנות לגבי תהליך זה. בנוסף, תהליך המעבר של המולקולה הוא מהיר מאוד וכמעט בלתי ניתן למדידה. הפחתת המתח של המעבר מגדיל את זמני המעבר הממוצעים, אך תהליך הדיפוזיה (שמגביר את הרעש של המערכת) הופך לאיטי יותר אך גם לתהליך פחות מבוקר ומסודר. תוצאה זאת משאירה את החוקרים עם מידע בלתי מספק לקביעת רצף גדיל הדנ"א מסיבות שאינן בשליטתן. בשביל לנסות ולפתור את בעיית המעבר ניסו להשתמש בדופלקס של דנ"א לא מזווג. הקינטיקה של התהליך צריכה להיות יותר מבוקרת בעזרת בחירת מתח התעלה וגודל הדופלקס. למרות זאת, דנ"א לא מזווג לא יכנס לתוך התעלה בסיס אחר בסיס בשל המבנה של הדופלקס שהוא מבנה יציב יותר הבנוי מכמה נוקלאוטידים אשר לא מאפשרים את המעבר בתוך התעלה באופן של בסיס אחר בסיס. המסקנה הנ"ל מצריכה את החוקרים להרחיב את החומצות האמינו הפנימיות וכתוצאה מכך זמן הריצוף מתארך. משימה זאת יכולה להיות מאתגרת מאוד בעיקר מהסיבה שיש את הצורך להגדיל את הפוטנציאל של התעלה המרצפת לקרוא מקטעים ארוכים יותר ולאורך זמן ארוך יותר. השימוש בשיטה של "צעד מוטורי תלוי אנזים" היא עוד דרך לויסות המעבר בתוך התעלה. לפי שיטה זאת האנזים דנ"א פולימראז משמש בשביל להניע את גדיל הדנ"א הבודד להיכנס לתוך התעלה בסיס אחד בכל פעם, כך שגדיל הדנ"א נמשך לתוך התעלה בעזרת כוחות חשמליים. למעשה התהליך הוא סימולטני בעוד שהדנ"א פולימראז מפלמר את גדיל הדנ"א מנקלאוטידים אשר בתמיסה הגדיל עצמו "משתחל" דרך התעלה המרצפת, בכל פעם שהאנזים משלב נוקליאוטיד לשרשרת, נוקליאוטיד אחד נדחף לתוך התעלה. ניתן לבקר את היעילות של האנזים בעזרת שינוי הריכוז של הנוקלאוטידים בתמיסה, שינוי המתח או בחירה של אנזים פולימרז שונה ויותר יעיל למדידה. היתרון של "צעד מוטורי תלוי אנזים" יכול להוות התקדמות גדולה תחום ולהוות פיתרון יעיל לריצוף מולקולת דנ"א ארוכה במעט זמן ובכמה שפחות משאבים ^[9].

הערות שוליים

^ ¹ ² http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/S0167-7799(06)00263-0
^ http://jcm.asm.org/content/31/1/22.short‏
^ F. Sanger, S. A. (1977). DNA seqencing with chain-terminating inhibitors. PNAS , 74 (12), 5463-5467.
^ http://genome.cshlp.org/content/11/1/3.short
^ http://www.pnas.org/content/93/24/13770.full
^ G.M. Church, D. D. (1998). Characterization of individual polymer moleules based on monomer-interface interface.
^ http://www.nature.com/nnano/journal/v4/n4/abs/nnano.2009.12.html
^ http://www.nature.com/nbt/journal/v30/n4/full/nbt.2181.html
^ ¹ ² ³ http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1571064512000395
^ http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.201200266/abstract
^ ¹ ² http://www.pnas.org/content/106/19/7702.abstract
^ http://www.nature.com/nnano/journal/v6/n10/full/nnano.2011.129.html
^ http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt.1495.html
^ http://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/17435889.2.6.875?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed

ראו גם

ביוננוטכנולוגיה
[[[:en:Nanopore|Nanopore]]]
[[[:en:Nanopore sequencing|Nanopore sequencing]]]
ננו-חיישן

[1.-1] ¹ ² http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/S0167-7799(06)00263-0

[2] ttp://jcm.asm.org/content/31/1/22.short‏

[3] F. Sanger, S. A. (1977). DNA seqencing with chain-terminating inhibitors. PNAS , 74 (12), 5463-5467.

[4] ttp://genome.cshlp.org/content/11/1/3.short

[5] ttp://www.pnas.org/content/93/24/13770.full

[6] G.M. Church, D. D. (1998). Characterization of individual polymer moleules based on monomer-interface interface.

[7] ttp://www.nature.com/nnano/journal/v4/n4/abs/nnano.2009.12.html

[8] ttp://www.nature.com/nbt/journal/v30/n4/full/nbt.2181.html

[תשע-9] ¹ ² ³ http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1571064512000395

[10] ttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.201200266/abstract

[11.-11] ¹ ² http://www.pnas.org/content/106/19/7702.abstract

[12] ttp://www.nature.com/nnano/journal/v6/n10/full/nnano.2011.129.html

[13] ttp://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt.1495.html

[14] ttp://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/17435889.2.6.875?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]